در تكنیك ELISA  پروئین ها در سطح حفرات پلیت پوشش داده می شوند و در انتهای آزمایش ELISA ،از یك واكنش رنگ زا برای شناسایی انجام واكنش یا عدم انجام  آن استفاده می شود.اما در وسترن بلات ابتدا پروتئین توسط الكترو فورز روی ژل اكریل امید جدا شده ، سپس توسط جریان الكتریكی به غشاء نیترو سلولوز انتقال داده می شوند. این غشا شبیه به كاغذ معمولی است ، ام اندازه حفرات آن كاملا مشخص است و توانایی زیادی در اتصال به پروتئین دارد پس از اینكه پروتئین به غشاء نیترو سلولوز انتقال داده شد بقیه مراحل شبیه به ELISA  طی می شود ف با این تفاوت كه مسیر حركت هر نمونه به شكل یك نوار بریده می شود و درون ظزف خاصی كه شیار هایی به اندازه نوار بریده شده ، قرار می گیرد و بقیه مراحل در این ظرف انجام می گیرد .

 به این ترتیب به طور مثال اگر نمونه كشت ویروس HIV  در اختیار داشته باشیم ، باید ابتدا انرا الكترو فورز نماییم . پس از الكترو فورز باندهای پروتئینی را به gp۴۱  و gp۱۲۰ هر یك بنا به اندازه مولكول آن ها ، روی ژل تفكیك می شوند .اكنون باندهای پروتئین را به غشای نیترو سلولز انتقال داده تا مراحل بعدی به راحتی صورت گیرد.پس از اینكه پروتئین ها به غشای نیترو سلولوز منتقل شدند ، مرحله بعدی میتواند به دو گونه طراحی شود :

الف) بعضی از مواقع هدف شناسایی پروتئین خاص در پروتئین های الكتروفورز شده است . این حالت بیشتر در تحقیقات كاربرد دارد.

ب) در برخی موارد نیز مخلوط پروتینی ماهیت مشخصی دارد و حتی وزن مولكولی پروتئین های این مخلوط و موقعیت آن ها پس از الكترو فورز مشخص می باشند. در این موارد می توان حضور آنتی بادی علیه پروتئین های را در  سرم مورد آزمایش بررسی نمود. در اكثر موارد تشخیص از یان روش استفاده می شود . به طور مثال پروتئین های ویروس HIV  الكترو فورز شده ،سپس به غشای نیترو سلولوز منتقل می شود . اكنون پس از مجاورت با سرم انسانی هدف ازمایش بررسی وجود انتی بادی علیه پروتئین غشایی یا مركزی HIV  است. در این مواقع علاوه بر حضور یا عدم حضور آنتی بادی اختصاصی می توانیم مشخص سازیم كه آنتی فرد علیه چه جزئی از عامل بیماری زا است.

به این ترتیب موارد مثبت كاذب مشاهده شده در آزمون ELISA  در اینجا حذف می شود و به طور اختصاصی واكنش دهی آنتی بادی ،مورد آزمون قرار می گیرد . در بسیاری مواقع كه چندین بار (۲ تا ۳ بار) تست ELISA یك عامل عفونی خطرناك برای یك بیمار مثبت می گردد ، جهت تایید تست الایزا از تست وسترن بلات استفاده می شود نظیر عفونت های HIV ، HTLV و HSV .

البته امروزه برای بسیاری از عفونت های ویروسی و باكتریایی تست تایید وسترن بلات موجود است . به لحاظ تكنیكی در مواردی كه هدف ارزیابی حضور آنتی بادی خاص در یك سرم باشد ، مراحل ذیل دنبال می شود تا اینكه در انتها از طریق واكنش رنگ زایی رسوبی ، اتصال آنتی بادی به آنتی ژن مشخص گردد. از انجا كه جایگاه حركت و قرار گیری آنتی ژن روی نوار نیترو سلولز مشخص است ، می توانیم مشاهده واكنش رنگی را دلیل بر اتصال آنتی بادی اختصاصی به آن آنتی ژن بدانیم.

۱- الكترو فورز محلول پروتئین روی ژل پلی اكریل آمید در حضور سدیم دو دسیل سولفات.

۲- انتقال باندهای پروتئین جدا شده از ژل پلی آكریل آمید به كاغذ نیترو سلولز به وسیله جریان الكتریسیته.

۳- بریدن مسیر حركت پروتئین ها روی كاغذ نیترو سلولز به شكل نوار.

۴-مجاور كردن این نوارها با موادی نظیر BSA۲% یا شیر خشك بدون چربی تا اینكه سایر جایگاههای كاغذ نیترو سلولز پوشش داده شود و پروتئین های مراحل بعدی آزمایش به آن متصل نگردد . در مواردی كه از كیت های تجاری استفاده می شود ، معمولا نوار های بریده شده نیترو سلولز كه پروتئین ها به آن انتقال داده شده اند به همراه الگوی قرار گیری پروتئین ها در كیت وجود دارد. این نوارها معمولا مراحل بلكینگ را نیز پشت سر گذاشته اند.

۵- در این مرحله سرم مورد آزمایش با نوار نیترو سلولز مجاور می شود . مدت زمان مجاور سازی می تواند بین ۱ تا ۳ ساعت باشد.

۶- پس از چند بار شستشو نوار نیترو سلولوز (در همان شیار های مربوطه ) آنتی بادی ضد ایمونو گلبولین انسانی كونژوگه شده با انزیم  (در صورتی كه نمونه سرم مربوط به انسان باشد  ) اضافه می شود و پس از ۲-۱ ساعت (همراه با حركت دادن ظرف ) نوارها   ۳تا ۵ بار توسط بافر مخصوص شستشو می شوند.

۷-با ریختن سوبسترای انزیم بر روی نوار واكنش رنگی رسوبی در محل اتصال آنتی بادی ایجاد می شود كه می تواند نشانگر حضور آنتی بادی عبیه آنتی ژن خاص باشد . نوع سوبسترا به كار رفته وابسته به انزیمی است كه به انتهای آنتی بادی ضد ایمونوگلوبین انسانی متصل است . در مواردی كه این آنزیم ‌Horse Radish Peroxdase  باشد، سوبسترای بكار رفته می تواند دی- آمینو بنزیدین و H۲O۲ باشد كه آنزیم با اكسید كردن دی – آمینو بنزیدین ، رنگ قهوه ای تیره ای را در محل واكنش آنتی بادی – آنتی ژن رسوب میدهد.

بر گرفته از: كتاب روش های عملی در ایمنولوژی