تبلیغات 
استخراج DNA با استفاده از روش فنول کلروفرم بهترین روش استخراج DNA
مواد مورد استفاده:
فنول ، کلروفرم، EDTA)Lysis،Tris،D.W،(SDS،آمونیوم
استات،اتانول 100,70%، Protenas K، Solvent
لوله فالکون حاوی فنول باید درون دمای یخچال و به صورت
ایستاده قرار گرفته باشد(چون حاوی دو فاز می باشد و نباید دو فاز با هم مخلوط
شوند.فاز زیرین حاوی ترکیب فنول و فاز رویی حاوی Tris جهت جلوگیری از اکسیده شدن محلول فنول می باشد).از قبل
محلولی جهت لایز کردن دیواره سلولی آماده کردیم(از ترکیبی از موادTris
10mµ 0.1211gr , EDTA 0.1µ 3.722 gr , SDS 0.5% با D.Wبه حجم 100ml
رساندیم.جهت اینکه
این مواد خوب در محلول حل شوند مقداری ورتکس کردیم و به مدت 15minدر دمای 50 درجه سانتی گراد دستگاه فور گذاشتیم).مراحل
انجام کار چه افزودن و چه برداشتن محلول در این روش زیر هود انجام می گیرد.
100µlاز Buffy coatکه قبلا آماده کردیم را درون میکروتیوپ 2ml می ریزیم، بعد 400µl از محلول lysis که قبلا آماده کردیم را به آن اضافه و 3تا 6 ثانیه ورتکس تا خوب در هم حل شوند بعد 10 ثانیه میکروفیوژ میکنیم تا محلولی که به دواره و در میکروتیوپ چسبیده به قسمت پایین میکروتیوب بیاید،در مرحله بعد به مدت یک ساعت میکرو تیوب ها را در دمای 25 درجه سانتی گراد Dry-block قرار میدهیم تا محلول حاوی لایزز بتواند دیواره سلولی را باز کرده و محتویات سلولی را در دسترس قرار دهد.بعد از زمان مورد نظر به هر میکروتیوب 2 µlاز Protenas K اضافه،3 تا 4 ثانیه ورتکس و بعد 10 ثانیه میکروفیوژ و بعد به مدت 3ساعت میکرو تیوب ها را در دمای 25 درجه سانتی گراد Dry-block قرار میدهیم تا Protenas K درون محلول بتواند DNAدرون هسته را جدا می کند.داخل یک بشر 50ml محلول ویست 10%جهت غیر فعال کردن مواد و محلول های اضافی درست میکنیم(شامل 10mlاز محلول وایتکس و90mlآب)در مرحله بعد چون مواد و ناخالصی های درون محلول(شامل دیواره های سلولی) زیاد شده هم حجم محلول درون میکروتیوب از محلول فنول اضافه و 10 ثانیه ورتکس انجام می دهیم و بعد هم حجم فنول به محلول کلرو فرم(باید در دمای یخچال نگهداری شود) اضافه می نماییم و مجددا 10 ثانیه ورتکس میکنیم و بعد 15min با دور 14000rpm در دمای 4 درجه سانتی گراد سانترفیوژ(یخچال دار) می نماییم.در این مرحله فنول باعث جدا سازی هیستون ها و پروتئین ها از DNAشده و آن را خالص و عاری از هر ناخالصی می کند،نباید زیاد فنول را درون محلول نگه داشت زیرا باعث میشود که به خود DNA هم آسیب برسد،کلروفرم هم باعث می شود که فاز آلی و آبی از هم جدا شوند، فاز آلی که در پایین میکروتیوب قرار می گیرد شامل فنول ،کلروفرم، و مواد اضافی و جدا شده از DNA(دیواره سلولی و پروتئین ها) می باشد. فاز رویی هم شامل آب و DNA می باشد،بعضی از میکروتیوب ها هم یک رینگ بین فاز آلی و فاز آبی تشکیل می دهند شامل پروتئین جدا شده از DNA می باشد که این رینگ به رنگ شیری کدر از دو فاز قابل تمایز می باشد.
باید به آرامی میکروتیوب ها را از درون دستگاه سانترفیوژ خارج کرد که فاز ها با هم مخلوط نشوند،بعد زیر هود فاز رویی را درون یک میکروتیوب دیگر میریزیم (به هیچ عنوان نباید رینگ حاوی پروتئین بین دو فاز به فاز آبی به میکروتیوب جدید منتقل شود زیرا در مرحله آخر مشاهده باند اسمیر فراوان مانع دیدن باند می گردد).فاز زیری(فاز آلی)را درون ظرف ویست که از قبل آماده کردیم میریزیم تا اگر DNA یا مواد دیگر در آن باشد غیر فعال شوند. در صورتی که محلول آبی که جدا کردیم کدر باشد یک بار دیگر مرحله قبل را تکرار(یعنی هم حجم این محلولی که داریم کلروفرم اضافه میکنیم تا ضایعاتی که درون محلول مانده جدا کند و مجددا فاز رویی را درون یک میکروتیوب دیگر می ریزیم.در این مرحله دیگر نیازی به افزودن فنول نیست،فقط کلروفرم اضافه و مراحل را انجام می دهیم).
در مرحله آخر جدا کردن فاز آبی میزان دقیق فاز آبی را با کشیدن با سمپلراندازه میگیریم،بعد به اندازه 0.2 درون هر میکروتیوب که جدا کردیم استات آمونیوم 10 µ اضافه و دو برابر حجم اتانول 100% اضافه میکنیم .در این مرحه وقتی حلال آب باشه چون قدرت یونی نسبتا بالایی داره مولکول های اسیدنوکلئیک (گروه های فسفات باردار) با آب واکنش میدن و خوب در آب حل می شوند (به همین جهت با محلول های آلی میشود اسید نوکلئیک را از بقیه ی اجزای سلولی جدا کرد). وقتی اتانول به محلول اضافه میشود قدرت یونی حلال کم و تمایل اسید نوکلئیک هم به حلال کم و با یون های موجود در محیط(در اینجا استات آمونیوم) واکنش و سنگین میشود و رسوب می کند. نباید در این مرحله با دستگاه ورتکس محلول را بهم زد زیرا رشته های DNA شکل گرفته و در صورت ورتکس آنها تیکه تیکه می شوند و برای همین باید به آرامی بین انگشتان دست به مدت 10 دقیقه میکروتیوب ها را تکان داد تا خوب محلول حل شود در این مرحله میتوان بار اول تکان دادن میکروتیوب ، با چشم غیر مسلح رشته های DNA که با ترکیب آمونیوم استات ضخیم شده اند را مشاهده نمود.بعد میکروتیوب ها را جهت آبگیری هر چه بهتر اتانول به مدت حداقل یک ساعت درون فریزر با دمای -20 قرار داد که ما در این مطالعه به مدت 16 ساعت این مرحله را انجام می دادیم در صورتی که خوب اتانول با محلول حل نشده باشد محلول دچار یخ زدگی میشود زیرا اتانول عمل آبگیری را انجام می دهد.بعد از این مرحله میکرو تیوب ها نباید دچار یخ زدگی شده باشند،در صورت یخ زدگی باید منتظر ماند تا در دمای محیط یخ آنها باز شود و بعد در دستگاه سانتر فیوژ با دور 14000rpm و زمان 15min و دمای 4درجه سانتی گراد سانترفیوژ را جهت رسوب DNAانجام می دهیم،در این مرحله مثل مراحل قبل یک ظرف حاوی محلول ویست آماده می نماییم،بعد از اتمام سانترفیوژ محلول را به صورت یکدفعه درون ظرف ویست خالی میکنیم و آن را بر میگردانیم در مرحله بعد به هر میکروتیوب حاوی رسوب DNA به اندازه مجموع حجم Buffy Coat اولیه و مححلول لیزیز که جمعا 500mlشده بود الکل 70% اضافه میکنیم و به آرامی 3تا 6 ثانیه ورتکس میکنیم تا رسوب DNAدرون الکل حل شود .سپس با دور 14000rpm، دمای 4درجه سانتی گراد،10min سانترفیوژ می کنیم.بعد از سانترفیوژ محلول را دروز ضرف ویست خالی میکنیم و روی گاز استریل میکروتیوب ها را برمیگردانیم تا قطرات الکل باقی مانده خالی شود بعد میکرو تیوب ها را در دمای 37 درجه سانتی گراد Dry-block قرار میدهیم تا قطرات الکل از میکرو تیوب بخار شوند،جهت فهمیدن اینکه الکل کامل از میکروتیوب کامل بخار شده یا نه میکروتیوب رو روبروی چشممان میگیریم و و با انگشت به آرامی به ته میکرو تیوب ضربه میزنیم که اگه قطرات ریزی مانده باشده مشخص می شود.بعد از تبخیر کامل الکل از میکرو تیوب ها به ازای 100mlاز Buffy Coat اولیه به هر میکروتیوب 20 µl از محلول Solvent کیت DNPTM اضافه و بعد میکروتیوب ها را به آرامی 3تا 6 ثانیه جهت حل شدن DNAدرون Solvent به آرامی ورتکس می کنیم بعد 2 دقیقه میکروتیوب ها را در دمای 37 درون Dry-block جهت بهتر حل شدن DNA قرار می دهیم و سپس میروتیوب های حاوی محلول DNAرا به درون فریزر با دمای -20 درجه سانتی گراد جهت انجام PCR قرار می دهیم. حداقل باید یک ساعت نمونه جدا شده DNAدرون فریزر بماند و بعد PCR انجام شود.
گردآورنده: احمد نیکنام
جهت هر گونه سوال در مورد این روش با این ایمیل در تماس باشید
AHMADNIKNAM@HOTMAIL.COM
طبقه بندی: بیوتكنولوژی و ژنتیك،
برچسب ها: بهترین روش استخراج DNA، استخراج DNA با استفاده از روش فنول کلروفرم، بهترین روش خالص سازی DNA، بهترین روش جداسازی DNA، روش فنول کلروفرم، تخلیص DNA،
نجفی علی,قربان علی زادگان مهدی,توكلی حمید*,احمدی علی
* گروه تغذیه مرکز تحقیقات بهداشتی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه اله (عج)
زمینه و اهداف: در حال حاضر روش استاندارد برای تشخیص لیستریا مونوسیتوژنز كشت می باشد. به علت این که در خوراک دام از آنتی بیوتیك استفاده می شود و این باکتری داخل سلولی می باشد حساسیت كشت به شدت كاهش می یابد. به علاوه، تشخیص با این روش بیشتر از 36 ساعت طول می کشد. لذا، دست یابی به آزمونی كه بتواند در هر شرایطی وجود لیستریا مونوسیتوژنز را در نمونه بالینی نشان دهد، ارزشمند می باشد. هدف این مطالعه تشخیص سریع مولکولی لیستریا مونوسیتوژنز به روش PCR با استفاده از ژن hlyA بود.
روش بررسی: ژن hlyA به عنوان ژن اختصاصی برای شناسایی لیستریا مونوسیتوژنز انتخاب گردید. به منظور بهینه سازی آزمایش از سویه استاندارد لیستریا مونوسیتوژنز PTCC: 1163 استفاده شد. برای بررسی اختصاصیت از باکتری های سالمونلا تیفی PTCC: 1609، لیستریا مونوسیتوژنز PTCC: 1163 و اشریشیاکلی ATCC: 35218، استفاده شد. برای استخراج DNA از روش فنل - کلروفرم استفاده شد و محصول 210bp پس از الکتروفورز در ژل آگارز %1 در دمای اتاق با رنگ اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی و مورد شناسایی قرار گرفت.
یافته ها: نتایج این مطالعه نشان داد که سویه استاندارد محصول مورد نظر را تولید می نماید. در حقیقت، جفت پرایمر انتخاب شده محصولی در اندازه 210bp تولید می کند. آزمایش اختصاصیت نشان داد که روش حاضر با هیچ یک از باکتری های غیرهدف واکنش نشان نمی دهد. بررسی حساسیت نشان داد که حد نهایی تشخیص DNA لیستریا مونوسیتوژنز در این روش 500fg می باشد.
نتیجه گیری: نتایج بهینه سازی نشان داد که روش PCR به كار رفته در این مطالعه از سرعت، حساسیت و اختصاصیت لازم برخوردار است و نتیجه نهایی در کمتر از سه ساعت بدست می آید. به کارگیری این روش در آزمایشگاه ها تشخیص لیستریا مونوسیتوژنز را امکان پذیر می نماید.
كلید واژه: لیستریامونوسیتوژنز،PCR ، ژن hlyA
طبقه بندی: بیوتكنولوژی و ژنتیك،
برچسب ها: تشخیص سریع مولکولی لیستریامنوسیتوژنز، استفاده از ژن hlyA، روش PCR،
October 12, 2010 - October 14, 2010
V National Congress of Gerontologists and Geriatrician
Kiev, Ukraine
October 13, 2010 - October 16, 2010
7th World Stroke Congress, organized by the World Stroke Organization (WSO)
Seoul, Korea, Republic of
October 14, 2010 - October 16, 2010
Georgetown University Hospital Diabetic Limb Salvage Conference
Washington, DC, United States
بقیه را در ادامه مطلب بخوانید
طبقه بندی: اطلاع رسانی، بیوتكنولوژی و ژنتیك،
به كارگیری بیوتكنولوژی نوین در كشاورزی منجر به تولید ٿرآوردههای با كیٿیت بهتر، كاهش هزینه تولید آن و تولید ٿرآوردههایی باارزش اٿزوده بیشتر میگردد. به همین دلیل، امروزه ٿعالیتهایگستردهای در بخش بیوتكنولوژی برای تبدیل تحقیقات پایهای بهكاربردی و توسعهای (تجاری) در حال شكلگیری است . به كارگیری روشها و ٿنون مهندسی ژنتیك و بیوتكنولوژی در كشتسلول و باٿت گیاهان به ویژه گیاهانی كه از جنبه اقتصادی و غذایی اهمیت ٿوقالعادهای دارند، بسیار ارزشمند است. چرا كه در مقایسه با شیوههای كشت و تكثیر معمولی از این روش میتوان با هزینهای بسیار كمتر وسرعت عمل بیشتری به دودمانهای خالص سلولی و انتخاب سالم ترین باٿت گیاهی با بازده كمی و كیٿی چشمگیری نائل شد. با به كارگیری بیوتكنولوژی میتوان گیاهی را تولید كرد كه به عواملی همچون سرما، گرما، رطوبت، خشكی، املاح، حشرات، آٿات ویروسها و سایر عواملبیماری زا مقاوم باشند و علاوه برآن در مقایسه با موجود طبیعی، مجهز به مكانیسمهای دٿاعی اضاٿی باشند. این عوامل قرنها است كه كشاورزان را آزار داده و لطمات بیشمار اقتصادی وارد كرده است.بیوتكنولوژی كاربردهای امیدوار كننده بسیاری دارد، اما نه یك راه حل عمومی و نه جایگزینی برای روشهای موجود است، بلكه یك روشكمكی برای حل مشكلات كشاورزی است. نمونههای ٿراوانی ازكاربردهای بیوتكنولوژی در كشاورزی امروز وجود دارد كه برخی ازنمونهها در ذیل اشاره میگردد:
كرم اگروتیس (شبپره زمستانی) یكی از حشرات آسیب رساننده بهغلات است كه معمولا به وسیله حشرهكشها با آن مبارزه میشود. باكتری با سیلوس تورژین سیس پروتئینی تولید میكند كه كشنده حشره ٿوقاست ولی این باكتری با غلات همزیستی ندارد . بیوتكنولوژیستها برایحل این مشكل ژن پروتئین تولیدی این باكتری را به باكتری پسودوموناس ٿلوئورسنس كه در خاك وجود داشته است و با سویاهمزیستی دارد انتقال دادند و سپس با وارد كردن این باكتری به خاكمحل كشت غلات، حشره ٿوق را كنترل نموده و صدمات ناشی از آن راكاهش دادند. این مثال نمونهای از كاربرد علم بیوتكنولوژی در كنترلحشرات و آٿات محسوب میشود.از ٿنآوری بیوتكنولوژی در كنترل علٿهای هرز نیز استٿاده گردیده است.
برای نمونه بسیاری از علٿكشها به دلیل حضور مادهای بنام گیلٿوسیت در علٿكش رانداپ كه تأثیر منٿی بر ٿعالیتهای آنزیمی حبوبات دارد، در مزارع حبوبات قابل استٿاده نیست.بیوتكنولوژیستها توانستهاند با انتقال ژن مقاومت به گلیٿوسیت (كه آنرا در نوعی باكتری به نام سالمونلا ٿلاتیٿی موریوم یاٿتهاند) به گیاهانزراعی، واریتههای جدیدی از ذرت، پنبه و تنباكوی مقاوم به علٿكشهارا تولید نمایند.
استٿاده از بیوتكنولوژی درگیاهان زراعی در اٿزایش كیٿی گیاهانزراعی نیز مؤثر بوده است، به طوری كه گیاهان تراریخته كه از طریق بیوتكنولوژی به دست آمدهاند نسبت به ارقام قدیمی تولید بیشتری داشتهاند كه این اٿزایش بهرهوری به دلیل عواملی چون تحمل بهخشكی، مقاومت به حشرات، بیماریها و قدرت رقابت بیشتر با علٿهای هرز بوده است. همچنین بیوتكنولوژیستها موٿق شدهاند مكانیسمی كه موجب نرمشدگی و ٿساد میوههایی چون گوجه ٿرنگی میشود را با استٿاده ازروشهای مهندسی ژنتیك تحت كنترل خود در آورده و موجب حذٿشیمیایی موادی میشوند كه موجب رسیدگی بیش از حد محصولمیشود. با استٿاده از این تكنیك ، گوجه ٿرنگی Flavrsavr را تولیدنمودند كه میوهها به حالت طبیعی رسیده و پس از برداشت، بدون اینكهمیوهها در معرض ٿساد قرار گیرند به مساٿتهای دور قابل حمل بودند.
ایجاد مقاومت در مقابل تنشهای محیطی مانند خشكسالی، گرما،سرما، ازن موجود در اتمسٿر، نمك و مواد كانی از دیگر اهداٿ بیوتكنولوژیستها بوده است. در این مورد میتوان به تولید سیبزمینی وتوت ٿرنگی مقاوم به یخبندان كه از طریق مهندسی ژنتیك بدست آمده،اشاره نمودد.
كشت سلولی كه طی آن سلولهای گیاهی رشد یاٿته در محیطكشت، به عنوان منبع تأمین كننده مواد ارزشمندی محسوب میگردند، ازدیگر كاربردهای بیوتكنولوژی میباشد. برای نمونه، وانیل معمولا از بذرگیاه وانیلا بدست میآید. استخراج وانیل از سلولهای گیاهی كشت شده میتواند ارزان تر از روشهای سنتی تمام شود. علاوه بر این از كشتسلولهای گیاهی در محیط كشت، می توان ساقه و ریشه تولید كرد كهبرخی از این اندامها میتوانند به دلیل جهش دارای صٿات متٿاوتی باشند كه قابل بهره برداری خواهند بود.علاوه بر موارد ذكر شده به اختصار، برخی از كاربردهای بیوتكنولوژی را میتوان بصورت ذیل عنوان کرد:
2- مراقبت از گیاهان در مقابل بیماری های گیاهی ( گیاهانی مثل پایه نیشکر که از کشت باٿت مریستمی به دست می آیند مقاومت بالایی نسبت به بیماری ها دارند )
3- توسعه گونه های جدید به وسیله گداختن پروتوپلاسم یا پروسه کلون سا زی
4- تولید تركیبات مؤثر و مهم گیاهی از راه كشت انبوه سلولی
5- استٿاده از گیاهان به عنوان عوامل و منابع تولید محصولات زیستشناسی و شیمیایی
6- مطالعه ٿرآیندهای رشد و نمو و تمایز آن
7- مقامت به تنش های زنده ( حشرات، ویروس ها و بیماری های قارچی و باکتریایی )
8- مقاومت به تنش های غیر زنده
9- مقاومت به علٿ کش ها
10- گیاهان تراریخت برای بهبود کیٿیت ( کیٿیت انباری )
11- گل های تراریخت برای رنگ گل
12- گیاهان تراریخت برای نر عقیمی
13- گیاهان تراریخت برای تولید بذور خاتمه دهنده ( به تکنولوژی که قابلیت حیات یا باروری بذور را پس از یک مدت معین خاتمه می دهد ، خاتمه دهنده یا Terminator technology می گویند. بدین ترتیب شرکت تولید کننده ، بذور نسل اول را می ٿروشد اما بذور و یا میوه های حاصل از این گیاهان ٿقط به عنوان غذا قابل استٿاده هستند و اگر کشت شوند جوانه نخواهد زد )
14- گیاهان تراریخت به عنوان بیوراکتورها ( برای تولید ارزان مواد شیمیایی و دارویی که این پدیده به زراعت مولکولی یا Molecular farming معروٿ می باشد)
15- تولید پلاستیک قابل تجزیه زیستی (Biodegradable plastic )
16- استٿاده از آنزیمها در تولید مواد شیرین كننده تولیدات غذایی انسان
17- كنترل و دٿع آٿات گیاهی و تهیه انواع كودهای زیستی وحشرهكشهای میكروبی
18- اصلاح ژنتیك بذر و دانههای روغنی
19- كاهش اثرات مخرب كشاورزی بر محیط خاك
20- غنیسازی خاك و حاصلخیز كردن آن با استٿاده از میكروارگانیسمهای تثبیت كننده ازت و قارچ میكوریزا
21- استٿاده از ایجاد مصونیت برخی مواد شیمیایی گیاهان در برابر امراضمزمن انسانی
22- تهیه نوعی آلبومین انسانی در گیاهان با دستكاریهای ژنتیكی
23- استٿاده از هورمونهای رشد در دامها
24- تلقیح مصنوعی دامها و بهره گیری از صٿات برتر ژنتیكی در روش هایانتقال جنین
25- كاربرد در صنایع غذایی تبدیلی و كاهش هزینههای تولید موادغذایی
26- تهیه و تولید واكسنهای مٿید و جدید برای پیشگیری از عٿونتهای مرگآور در دامها و طیور
طبقه بندی: بیوتكنولوژی و ژنتیك،
| Databases | |||||||||||||||
| |||||||||||||||
| E. Journals | |||||||||||||||
| |||||||||||||||
| Evidence Base Medicine | |||||||||||||||
| |||||||||||||||
| E. Books , Atlases & CME | |||||||||||||||
| |||||||||||||||
| Medical Images, Protocol, Interactive Skills & Procedure | |||||||||||||||
|
طبقه بندی: هماتولوژی، دانلود كتاب، ویروس شناسی، بیوتكنولوژی و ژنتیك، میكروب شناسی،
